一、牧业报告：添加剂成分及安全性/蛋鸡试验报告

二、HB-101你我旺对中华鳖非特异性免疫功能和抗病力的影响

三、HB-101对中华鳖非特异性免疫功能影响的初步研究

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三、HB-101对中华鳖非特异性免疫功能影响的初步研究

陈昌福(1，3) 陈 萱(2)祝景琳(1) 罗宇良(1)
(1)华中农业大学水产学院，武汉 430070；
(2)华中农业大学科学技术学院，武汉 430070；
(3)华中农业大学农业微生物学国家重点开放实验室，武汉 430070)
陈昌福 教授电话:027-87286037 chenchangfu@mail.hzau.edu.cn

　　摘要:本文报道HB-101对中华鳖(Pelodiscus sinensis)非特异性免疫功能影响的试验结果。实验共分为3个组，在中华鳖饲料中添加2.0mL/kg.B.W.HB-101作为试验组，将添加1000.0 mg/kg.B.W.免疫多糖(酵母细胞壁)作为免疫刺激剂对照组，以投喂未添加HB-101和免疫多糖(酵母细胞壁)饲料的作为对照组。连续投喂28 d后，取中华鳖的血液，测定了中华鳖血液中白细胞的吞噬活性、血清溶菌活力和补体活性。研究结果表明，在中华鳖饲料中添加HB-101和免疫多糖(酵母细胞壁)能显著提高中华鳖白细胞的吞噬活性(t测验，P<0.05)，而2个试验和之间中华鳖血液中白细胞的吞噬活性没有显著差异(t测验，P>0.05)，2个试验组中华鳖血清中补体C3和C4的活性与对照组之间出现显著差异(t测验，P<0.05)，而试验组之间无显著性差异(t测验，P>0.05)。研究结果证明在中华鳖饵料中添加免疫多糖(酵母细胞壁)和HB-101对中华鳖的免疫功能具有增强作用。

　　关键词:中华鳖；HB-101；免疫多糖(酵母细胞壁)；白细胞；溶菌酶；补体
　　
　　 HB-101是日本国FLORA股份有限公司以松、杉和车前草等植物为原料，从中提取并经特殊工艺加工制成的一种纯天然植物活性物质。有研究结果证明这种物质不仅具有很强的抑、杀菌和驱虫活性，而且可以通过改善动、植物的微生态结构和调节动物机体的非特异性免疫功能，达到防除植物病虫害和改善饲养动物的饲料效率和健康状况并能提高其肉品的品质[1]。　　　　　　
　　 本研究将这种物质定量添加在中华鳖(Pelodiscus sinensis)的饲料中，连续投喂中华鳖后，通过检测供试中华鳖血液中白细胞的吞噬活性、血清溶菌酶活性和补体活性等免疫学指标，并与投喂免疫多糖(酵母细胞壁)的中华鳖的相应指标进行比较，系统地评价了HB-101对中华鳖的免疫刺激效果。

1 材料和方法
1.1 供试中华鳖稚鳖和饲养条件
　　 试验在武汉多福科技农庄股份有限公司梁子湖特种水产苗种基地的中华鳖越冬温棚内饲养池中进行。在每个25.0 M2的饲养池内饲养有平均体重70.0 g左右的800~900只中华鳖稚鳖，温室内温度控制在(31±3)℃，光照为人工光照和自然光照。每天上午9：00和下午6:00各投一次饵料，将饵料加少量水合成面团后投喂，投饵量以使中华鳖达到饱足并有少量剩余为准。投饵2 h后，取出剩余饵料，所换水为预先加温至(31±1)℃的水。所用饲料为武汉高龙饲料有限公司生产的全价稚鳖饲料，对照组所用饲料中除没有添加HB-101和免疫多糖之外，其它营养成分均没有改变。

1.2 HB-101和免疫多糖(酵母细胞壁)
　　 用于本研究的HB-101由泰富生命工程(武汉)有限公司提供。用于本研究的免疫刺激剂是湖北安琪酵母股份有限公司以医药专用酵母生产的福邦牌免疫多糖(酵母细胞壁)，该产品中主要含有β-葡聚糖≥20.0%，α-甘露聚糖肽≥20.0%，肽类及蛋白质≥30.0%，几丁质≥2.0%。

1.3 HB-101和免疫多糖(酵母细胞壁)饲料制作
　　 将HB-101和免疫多糖(酵母细胞壁)按一定剂量添加在饲料中，加适量水搅拌，然后放入搅拌机中混合均匀，制成面团装饲料投喂，饲料均为现配现用。

1.4 实验设计
　　 在全30个相同规格的饲养池中随机选取3个条件相同的饲养池作为试验池。将试验中华鳖幼鳖随机分成3组。在饲料中添加2.0 mL/kg.B.W.的HB-101作为试验组，将添加1000.0 mg/kg.B.W.已经被试验证明对中华鳖具有免疫刺激效果的免疫多糖(酵母细胞壁)作为免疫刺激剂对照组，而以投喂未添加HB-101和免疫多糖(酵母细胞壁)饲料的作为对照组。连续投喂28 d后，从各饲养池捞取部分中华鳖称重，并随机取10只中华鳖，供作采血、解剖观察和测定下列各项免疫指标的样本。

1.5 采血
　　 将从试验和对照池中取出的中华鳖幼鳖以切断颈部血管法采血，将每只鳖的血液分为2份，其中1份以肝素抗凝，制备抗凝血供测定吞噬细胞的吞噬活性用；另1份血液在4℃条件下离心制备血清，血清保存在-20℃冰箱中，以备下列指标的测定。

1.6解剖观察及脏器测量
　　 对采血后的中华鳖进行解剖，肉眼观察试验与对照组中华鳖脏器的异同，并对分离的器官和组织分别称重和测量，用以比较试验与对照组中华鳖的机体指标(简称体指)异同。

1.7 吞噬原的制备
　　 将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)接种在液体肉汤培养基中，37℃下培养48 h后，离心集菌，在菌液中加入浓度为0.5%的福尔马林，37℃下灭活24 h，经平皿培养法证实菌体已经被全部灭活后，用灭菌生理盐水清洗3次，并将其浓度调整至1.0×108cells/mL，即为福尔马林灭活的S. aureus菌体(formalin killed S.aureus, F-SA)，用作检测白细胞吞噬活性的吞噬原。

1.8 血液白细胞吞噬活性的测定
　　 在0.2 mL抗凝血中加入0.1 mL F-SA摇匀，在28℃的恒温水浴锅中孵育45 min，每隔10 min摇动1次。用吸管吸取血细胞涂片，每个样品涂5张，用甲醇固定10 min，Giemsa染色液染1 h，水洗风干后，镜检，并依下式计算白细胞吞噬百分比(phagocytic percentage，PP)和吞噬指数(phagocytic index，PI)。
吞噬百分比(PP)= (100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100)×100
吞噬指数(PI )= 细胞内总菌数/参与吞噬的细胞数

1.9 血清溶菌活力的测定
　　 参照文献[1]的方法进行。用0.067mol/L的磷酸缓冲液(PBS，pH 6.4)将溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)配制成0.2 mg/mL 的菌悬液。每个样品取3.0 mL菌悬液，吸取血清0.04 mL加入到菌悬液中，混匀后，立刻在540 nm下测定A。值。然后在28℃水浴中温育30 min，取出后置于4℃冰浴中终止反应，再测定A值。按公式计算溶菌酶的活性：U=(A。- A)/ A 。

1.10 血清补体C3和C4含量的测定
采用伊利康生物技术有限公司生产的试剂盒，分别要求加入各试剂及血清后，在37℃水浴10分钟，用透射比浊法在722型紫外分光光度计340nm波长处读取测定管和标准管的光密度值(A)，以计算补体C3和C4的含量。

2 结果
2.1 HB-101对中华鳖各项体指的影响
　　 经过肉眼观察和各项指标的测量结果，试验期间对照和试验组中华鳖幼鳖的增重量、器官颜色和各项机体指标均无明显差异，表明口服HB-101和免疫多糖(酵母细胞壁)对中华鳖的生长和机体各组织器官的正常生理机能没有不良影响

2.2 白细胞吞噬活性的变化
　　 供试中华鳖血液中白细胞的吞噬百分比和吞噬指数测定结果如表1所示：

表1 供试中华鳖血液中白细胞的吞噬活性
Table1 Phagocytic activity of leucocytes in the blood of soft-shelled turtle
(Pelodiscus sinensis)

　　由表1可以看出，投喂免疫多糖和HB-101的中华鳖血液中白细胞的PP和PI均高于对照组，PP最高的是免疫多糖(酵母细胞壁)投喂组，而PI最高的是HB-101组，统计分析结果表明，投喂免疫多糖(酵母细胞壁)和HB-101的试验组之间没有显著性差异(t测验，P>0.05)；而2个试验组的PP和PI均显著高于对照组(t测验，P<0.05)。

2.2 溶菌酶和补体活性的变化
　　 供试中华鳖血清中溶菌酶与补体活性的测定结果如表2所示：

　　表2 　供试中华鳖血清中溶菌酶和补体的活性
　　 Table 2 　Lysozyme and complement activity in the serum of soft-shelled turtle
(Pelodiscus sinensis)

　　由表2可以看出，投喂免疫多糖(酵母细胞壁)和HB-101的中华鳖血清中的溶菌酶活性均显著高于对照组(t测验，P<0.05)，而这2个组之间之间没有显著性差异(t测验，P>0.05)。
　　 供试中华鳖血清中补体C3和C4的含量测定结果表明，投喂免疫多糖的和HB-101的中华鳖血清中补体C3和C4的活性均显著高于对照组(t测验，P<0.05)，而这2个组之间的补体C3和C4活性无显著性差异(t测验，P>0.05)。

3 　讨论
3.1 HB-101和免疫多糖(酵母细胞壁)促进中华鳖白细胞的吞噬作用
　　 利用异育银鲫(Carassius auratus gibelio)[2]、日本鳗鲡(Anguilla japanica)[3]和黄鳝(Monopterus albus)[4]等鱼类进行的试验结果已经证明，免疫多糖(酵母细胞壁)对鱼类是一种良好的免疫刺激剂(immunostimulants)。通过检测受试动物血液中白细胞的吞噬活性是评价免疫刺激剂效果的有效方法[5~11]。Brattgjerd等对大西洋鲑注射酵母葡聚糖后，发现试验鱼的巨噬细胞在离体条件下的吞噬活性和产生H2O2量上升[6]。Engstad等的研究证明了大西洋鲑的巨噬细胞上存在β-葡聚糖的受体(receptor)[9]。本研究结果证明了HB-101与免疫多糖(酵母细胞壁)一样，能显著地促进中华鳖血液中白细胞的吞噬作用。但是，HB-101促进中华鳖血液中白细胞吞噬活性的机制与中华鳖是否与免疫多糖(酵母细胞壁)存在差别，还有待深入研究。

3.2 　HB-101和免疫多糖(酵母细胞壁)对中华鳖血清溶菌酶和补体活性的影响
　　 溶菌酶是存在与动物体液中重要的非特异性免疫因子，在受到外来抗原性物质刺激后溶菌酶的活性通常会上升[12，13]。鱼类本研究结果表明，对中华鳖连续投喂拌有HB-101和免疫多糖(酵母细胞壁)的饵料，对中华鳖补体C3的合成有明显的协同作用，在酵母免疫多糖的最高剂量组，补体C3含量最高，并且明显高于其它组；但二者合用对补体C4却没有此影响，而酵母免疫多糖的缺乏则能抑制补体C4的产生。酵母免疫多糖联用对补体C3的协同作用，可能是由于它们相互促进了对方在肝脏中的含量，促进了肝细胞的功能所致，因为补体的主要合成部位是肝脏。刘晓冬等[13]对老龄小鼠的研究发现，酵母免疫多糖单独及与酵母免疫多糖联合应用，均能明显降低其肝脏和血清中脂质过氧化物和肝细胞凋亡的发生率，提高肝细胞的增殖能力，而且酵母免疫多糖对降低脂质过氧化物有协同效应。至于酵母免疫多糖联用对补体C4合成没有影响，则可能是因为实验所用的酵母免疫多糖的剂量没有满足促进补体C4合成所需要的剂量。
　　 综上所述，除了血清补体C4外，酵母免疫多糖合用对中华鳖稚鳖的非特异性免疫功能有明显的协同促进作用，并且在酵母免疫多糖的最高剂量组到达各自的最大值。这说明本实验范围内，饵料中添加2500mL/kg酵母免疫多糖和250mL/kg的酵母免疫多糖能达到中华鳖的最佳免疫效果。

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收稿日期：2004-05-20
陈昌福，男，1952年生. 博士，教授. 工作单位：华中农业大学水产学院. 武汉 430070

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　 Effect of HB-101 on Non-specific Immune Function
in Juvenile Soft-shelled Turtles (Pelodiscus sinensis)
by Oral Administration

Chen Changfu (1，3) Chen Xuan(2) Zhu Jinglin(1) Luo Yuliang(1)
(1)Fisheries College，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070 China；
(2)College of life science of Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070；
(3)State Key Laboratory of Agricultural Microbiology of Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)

Abstract 　The effect of the dietary HB-101 on non-specific immune function in juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)was studied. The turtles were divided into 3 groups and were fed with feed supplemented with HB-101, immunopolysaccharide (yeast cell wall), that was 2.0 mL/kg(HB-101 group)、1000.0 mg/kg.B.W.(immunopolysaccharide group)and 0.0 mg/kg.B.W.(control group), respectively. 28 days later, the turtles were blooded, and the phagocytic activity of the leucocytes, serum lysozyme activity and complement activity were monitored. The results showed that the phagocytic activity and lysozyme activity in HB-101 group and immunopolysaccharide group were significantly higher than the control group (t-test, p<0.05). However, there were no significant differences between HB-101 group and immunopolysaccharide group (t-test, p>0.05). The highest complement activity were observed in HB-101 group and immunopolysaccharide group, which were significantly higher than the control group(t-test, p<0.05). As the complement activity was concerned, there were no significant differences between HB-101 group and immunopolysaccharide group(t-test, p>0.05). The results demonstrate that the best supplementation ratio of the HB-101 in the soft-shelled turtle is about 2.0 mL/kg. B.W.

Keywods 　Soft-shelled turtle, HB-101, immunopolysaccharide (yeast cell wall), leucocyte，lysozyme, complement