覃川杰(3) 徐 镇(1) 肖志猛(1) 陈昌福(1，2)
(1)华中农业大学水产学院，武汉 430070；
(2)华中农业大学农业微生物学国家重点开放实验室，武汉 430070
陈昌福 教授电话:027-87286037 chenchangfu@mail.hzau.edu.cn
摘要 本文报道HB-101壮健极品对中华鳖(Pelodiscus sinensis)幼鳖非特异性免疫功能和抗病力影响的研究结果。试验共设6个组，在各组饵料中HB-101壮健极品的添加量依次为0 mg/kg(对照组)、10.0 mg/kg.B.W.(试验I组)、20.0 mg/kg.B.W.(试验Ⅱ)、30.0 mg/kg.B.W.(试验Ⅲ组)、40.0 mg/kg.B.W.(试验Ⅳ组)和50.0 mg/kg.B.W.(试验V组)。投喂30 d后，从每组中各取10只中华鳖幼鳖采血，测定了中华鳖幼鳖血液中白细胞的吞噬活性、血清中溶菌酶和补体活性；另从每组分别取30只中华鳖幼鳖用注射嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的方法行人工感染，检测其抗病力。研究结果表明，各试验组中华鳖幼鳖血液中白细胞的吞噬活性均显著高于对照组(t测验，P<0.05)。第Ⅰ和第Ⅱ组中华鳖幼鳖血清中溶菌酶活性与对照组之间没有显著性差异(t测验，P>0.05)，而试验Ⅲ、Ⅳ组和Ⅴ组中华鳖幼鳖血清中溶菌酶活性均显著高于对照组(t测验，P<0.05)。第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和第Ⅴ组中华鳖幼鳖血清中补体活性与对照组之间存在显著差异(t测验，P<0.05)，而第Ⅰ组与对照组之间无显著性差异(t测验，P>0.05)。投喂HB-101能增强中华鳖幼鳖对人工感染A. hydrophila活菌的抵抗力。研究结果证明在中华鳖幼鳖饵料中添加HB-101的量以20.0 mg/kg.B.W.左右为宜。
关键词 中华鳖幼鳖；HB-101壮健极品；溶菌酶；补体；抗病力；嗜水气单胞菌
作者等的初步研究结果已经证实，对中华鳖(Pelodiscus sinensis)投喂适量的HB-101壮健极品能增强其非特异性免疫功能[1]，说明HB-101壮健极品具有免疫刺激剂(immunostimulant)的特性，而且中华鳖的免疫系统同其它水产动物一样能被免疫刺激剂激活[2~9]。但是，关于HB-101壮健极品所诱导的中华鳖非特异性免疫机能对其抗病力有无影响，尚不清楚。Robertsen等将从酵母菌中提取的β-葡聚糖给予大西洋鲑(Salmon salar)后，活菌攻毒结果证明供试鱼对灭鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和鲁克耶尔森菌(Yersinia ruckeri)等致病菌感染的抵抗力显著增强[4]。Anderson等用注射和浸泡法对溪红点鳟(Salvelinus fontinalus)给予β-葡聚糖后，试验鱼对人工感染A. salmonicida 活菌的抵抗力也显著增强[5]。Brattgjerd等对大西洋鲑注射酵母葡聚糖后，虽然发现试验鱼的巨噬细胞在离体条件下的吞噬活性和产生H2O2量有所上升，但是，攻毒试验结果却表明试验和对照组鱼体之间抗感染力没有显著差异[6]。Jeney等将葡聚糖作为佐剂与A.salmonicida灭活菌苗联合使用，结果只是证明了能显著提高供试虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的部分非特异性免疫指标，而未对供试鱼进行抗病力的测定[7]。
本研究利用武汉泰富产业有限公司生产的HB-101健壮极品定量投喂中华鳖幼鳖后，在测定几种非特异性免疫指标变化的基础上，采用活菌攻毒的方法检测了供试中华鳖幼鳖的抗病力，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 供试中华鳖幼鳖和饲养条件
本研究中的中华鳖幼鳖饲养试验在武汉多福科技农庄股份有限公司梁子湖特种水产苗种基地越冬温室内饲养池中进行。在每个24.0 M2的水泥饲养池内饲养有平均体重63.0 g左右的600~650只中华鳖幼鳖，温室内温度变化在24℃~33℃之间，光照为人工光照和自然光照。每天上午9:00和下午6:00各投喂1次饵料，将饵料加少量水合成面团后投喂，投饵量以使中华鳖幼鳖达到饱食并有少量剩余为准。投饵4 h后，取出剩余饵料。所用饵料为武汉高龙饵料有限公司生产的全价幼鳖饵料，对照组所用饵料中除没有添加HB-101之外，其它营养成分均没有改变。
1.2 HB-101壮健极品
用于本研究的HB-101壮健极品是泰富生命工程(武汉)有限公司生产的粉剂。
1.3试验设计
在全60个同规格的饲养池中随机选取6个条件相同的饲养池作为试验池。将试验中华鳖幼鳖随机分成6组。由于中华鳖幼鳖外观上难以区分雌雄，因此，在本研究中不区分试验中华鳖幼鳖的性别。各组饵料中HB-101壮健极品的添加量分别为0 mg/kg(对照组)、10.0 mg/kg.B.W.(试验I组)、20.0 mg/kg.B.W.(试验Ⅱ组)、30.0 mg/kg.B.W.(试验Ⅲ组)、40.0 mg/kg.B.W.(试验Ⅳ组)和50.0 mg/kg.B.W.(试验Ⅴ组)。制作的饵料存放在阴凉处，每天喂食前4 h配制饵料。连续投喂30 d。
1.4 采血
在预定连续投喂30 d结束后的第2 d，从每个试验和对照池中随机捞取10只中华鳖幼鳖以断头法采血，将每只鳖的血液分为2份，其中1份以肝素抗凝，制备抗凝血供测定吞噬细胞的吞噬活性用；另1份血液置于4℃条件下离心制备血清，血清保存在-20℃冰箱中，以备下列指标的测定。
1.5解剖观察及脏器测量
对采血后的中华鳖幼鳖进行解剖，肉眼观察试验与对照组中华鳖幼鳖脏器的异同，并对分离的器官和组织分别称重和测量，用以比较试验与对照组中华鳖幼鳖的机体指标(简称“体指”)异同。
1.6 吞噬原的制备
将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)接种在液体肉汤培养基中，37℃下培养48 h后，离心集菌，在菌液中加入浓度为0.5%的福尔马林，37℃下灭活24 h，用灭菌生理盐水清洗3次，并将其浓度调整至1.0×108cells/mL，即为福尔马林灭活的S. aureus菌体(formalin killed S.aureus, F-SA)，用作检测血细胞吞噬活性的吞噬原。
1.7 血细胞吞噬活性的测定
在0.3 mL抗凝血中加入0.2 mL F-SA，摇匀，在25℃的恒温水浴锅中孵育45 min，每隔10 min摇动1次。用吸管吸取血细胞涂片，每个样品涂5张，用甲醇固定10 min，Giemsa染色液染1 h，水洗风干后，镜检，并依下式计算白细胞吞噬百分比(phagocytic percentage，PP)和吞噬指数(phagocytic index，PI)。
吞噬百分比(PP) =(100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100)×100
吞噬指数(PI )= 细胞内总菌数/参与吞噬的细胞数
1.8 血清溶菌酶活性的测定
以溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)冻干粉为底物，将底物用0.1mol/L的pH为6.4的磷酸钾盐缓冲液配成一定浓度的悬液(O.D.570≈0.35~0.5)。取3.0 mL该悬液与0.05mL待测血清于试管中混匀，测其在570 nm处的光密度值(A0)，然后置于37℃水浴保温30 min，取出后立刻置于冰浴中10.0 min以终止反应，测其在570 nm处的光密度值(A)。溶菌活力按下式计算：Uk=[(A0-A)/A]1/2
1.9 血清补体C3和C4活性的测定
采用伊利康生物技术有限公司生产的试剂盒，分别要求加入各试剂及血清后，在37℃水浴10 min，用透射比浊法在722型紫外分光光度计340 nm波长处读取测定管和标准管的光密度值(A)，以计算补体C3和C4的活性。
1.10 抗病力检测
将从患病中华鳖上分离的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)BS-1菌株[10]接种在BHI(Difco)培养基中，28℃条件下培养36 h后，离心法集菌并以除菌生理盐水调节菌液浓度至2.3×107cfu/mL备用。从各试验和对照组中分别随机捞取30只中华鳖幼鳖，经后肢窝对每只中华鳖幼鳖注射0.4 mL的A.hydrophila活菌液后，继续饲养观察21 d。对死亡的中华鳖幼鳖进行解剖并分离致病菌，以鼠抗A.hydrophila菌株血清与分离所得致病菌进行玻片凝集试验，判断是否由A.hydrophila感染致死。统计各组的死亡率，依下式计算相对保护率(Relative percent survival，RPS)。
相对保护率(RPS)= [1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100%
2 结果
2.1 HB-101健壮极品对中华鳖幼鳖各项体指的影响
对试验和对照中华鳖幼鳖体重与各项体指的测量结果如表1所示。试验期间对照和试验组
表1 对照和试验中华鳖幼鳖的增重量1)
Table 1 Growth of control and experimental juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)
1)10只供试中华鳖幼鳖的平均值，Mean value of 10 experimental juvenile soft-shelled turtle
中华鳖幼鳖的增重量、体重与内脏比和内脏与肝脏比，均无显著性差异(t测验，P>0.05)。此外，经过肉眼观察，对照与试验组中华鳖幼鳖的体形、内脏形态与颜色均未出现明显差别。表明各种剂量的HB-101健壮极品，对中华鳖幼鳖的生长和机体各组织器官的正常生理机能没有明显不良影响。
2.2 白细胞吞噬活性的变化
供试中华鳖幼鳖血液中白细胞的PP和PI测定结果如表2所示。由表2可以看出投喂HB-101壮健极品的中华鳖血液中白细胞的PP和PI均高于对照组，PP和PI最高的是HB-101健壮极品投喂量为40.0 mg/kg.B.W.的第Ⅳ组。统计分析结果表明，试验组中华鳖幼鳖血液中白细胞的PP和PI均显著高于对照组(t测验，P<0.05)，而各试验组之间没有显著性差别(t测验，P>0.05)。
表1 供试中华鳖幼鳖血液中白细胞的吞噬活性
Table 2 Phagocytic activity of leucocytes in the blood of juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)
组别 吞噬活性 Phagocytic activity
Groups PP PI
Ⅰ 51.2±5.6 4.37±0.46
Ⅱ 48.5±6.1 4.69±0.53
Ⅲ 49.7±5.9 4.54±0.63
Ⅳ 50.4±4.8 5.03±0.66
Ⅴ 48.6±5.3 5.12±0.74
对照 Control 38.8±4.9 3.59±0.52
2.3 溶菌酶和补体活性的变化
供试中华鳖幼鳖血清中溶菌酶与补体活性的测定结果如表3所示。由表3可以看出投喂HB-101壮健极品的试验组中华鳖幼鳖血清中的溶菌酶活性均高于对照组，溶菌酶活性最高的是HB-101壮健极品投喂量为40.0 mg/kg.B.W.的第Ⅵ组，其次是第Ⅴ组。统计分析结果表明，第Ⅲ组、第Ⅵ组和第Ⅴ组中华鳖幼鳖血清中溶菌酶活性与对照组之间存在显著性差异(t测验，P<0.05)；而第Ⅰ组和第Ⅱ组与对照组之间没有显著性差异(t测验，P>0.05)。
供试中华鳖幼鳖血清中补体C3和C4的活性测定结果表明，投喂HB-101壮健极品的中华鳖幼鳖血清中补体C3活性均高于对照组，补体C3和C4活性最高的是投喂量为50.0 mg/kg.B.W.的第Ⅴ组，其次是投喂量为120.0mg/kg.B.W.的第Ⅳ组。统计分析结果表明，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和第Ⅴ组中华鳖幼鳖血清中补体活性与对照组之间存在显著差异(t测验，P<0.05)，而第Ⅰ组与对照组之间无显著性差异(t测验，P>0.05)。
表3 供试中华鳖幼鳖血清中溶菌酶和补体C3、C4的活性
Table 3 Lysozyme and complement activity in the serum of juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)
组别 溶菌酶 补体活性 Complement activity
Groups Lysozyme C3 C4
Ⅰ 0.206±0.044 0.283±0.062 0.299±0.065
Ⅱ 0.228±0.056 0.312±0.057 0.314±0.065
Ⅲ 0.322±0.064 0.335±0.062 0.348±0.053
Ⅳ 0.365±0.042 0.372±0.051 0.366±0.072
Ⅴ 0.366±0.054 0.379±0.081 0.372±0.049
对照 Control 0.204±0.037 0.279±0.067 0.293±0.039
2.4 人工接种致病菌后中华鳖幼鳖的存活率
对照和试验组中华鳖幼鳖经活菌人工感染后，各组的死亡情况如表4所示。从表4 可以看
表4 活菌攻毒后中华鳖幼鳖的死亡率和相对保护率
Table 4 Mortality and relative percent survival(RPS)of juvenile soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)，after challenged with live Aeromonas hydrophila
组别 攻毒鳖只数 死亡鳖只数 死亡率 相对保护率
Number of fish Number of dead Mortality Relative percent
Groups Challenged Fish % Survival(RPS)%
Ⅰ 30 11 36.7 60.6
Ⅱ 30 10 33.3 64.3
Ⅲ 30 7 23.3 75.0
Ⅳ 30 8 26.7 71.4
Ⅴ 30 6 20.0 78.6
对照 Control 30 28 93.3
出经过投喂HB-101壮健极品1的中华鳖幼鳖均获得了比较高的RPS，而在饵料中添加HB-101健壮极品 30.0 mg/kg.B.W.以上的第Ⅲ、第Ⅳ和第Ⅴ组中华鳖幼鳖死亡率明显的低于添加量为10.0 mg/kg.B.W.和20.0 mg/kg.B.W.的第Ⅰ和第Ⅱ组。
3 讨论
与其他动物一样，中华鳖的非特异性免疫功能也包括体液免疫和细胞免疫部分[11]。在水产动物的细胞免疫中，血液中的白细胞的作用又是至关重要的[12]。鱼类的嗜中性白细胞和单核细胞已经被证明具有很强的吞噬能力，这种能力对于特异性免疫机能相对于高等脊椎动物比较低等的动物而言，具有更为重要的意义[13]。白细胞的吞噬功能是动物非特异性免疫的重要组成部分。因此，通过测定血液中白细胞的吞噬功能，可以反映机体的非特异性细胞免疫状态[14]。有研究结果证明了大西洋鲑的巨噬细胞上存在β-葡聚糖受体(receptor)，因此可以接受β-葡聚糖的刺激而增强其细胞的吞噬活性[15]。本研究的结果证明，在中华鳖幼鳖的饵料中添加HB-101壮健极品，能有效地增强白细胞的吞噬活性，说明这种物质对中华鳖幼鳖的免疫系统具有刺激作用。然而，关于这种物质究竟是作用于中华鳖幼鳖的何种免疫细胞而启动细胞免疫过程的，尚有待进行更为深入的研究。
溶菌酶的活性是决定吞噬细胞对所吞噬的致病菌能否被杀灭的物质基础之一[12]。因此，测定动物的溶菌酶活性，在一定程度上能反映动物非特异性体液免疫状态。鱼类血清中的溶菌酶活性可以因机体接触抗原性物质或者受到环境因子的刺激而上升[12，16]。本研究结果证明了在中华鳖幼鳖饵料中添加HB-101能提高其血清中溶菌酶的活性，而且在10.0mg/kg.B.W.至50.0 mg/kg.B.W.的添加量范围内，随着HB-101健壮极品添加量的提高，供试中华鳖幼鳖血清中溶菌酶的活性也逐渐提高。由于本研究中采用的最高添加量为50.0 mg/kg.B.W.，所以，更高用量的HB-101健壮极品对中华鳖幼鳖的免疫机能是否也有抑制作用，值得进一步研究。
动物体内的补体主要是由肝细胞和巨噬细胞合成的，而血清中的补体主要是来自肝细胞[14]。本研究结果表明投喂HB-101健壮极品可以增强中华鳖幼鳖血清中补体C3和C4的活性，试验组中华鳖幼鳖血清中补体C3和C4的活性均高于对照组。用A. hydrophila活菌对试验和对照组中华鳖幼鳖人工感染试验结果表明，口服给予HB-101健壮极品能提高中华鳖幼鳖对A. hydrophila活菌感染的RPS，并且其RPS的变化趋势与中华鳖幼鳖血液中白细胞的吞噬活性、血清中溶菌酶、补体活性上升趋势相一致，这种结果表明检测中华鳖幼鳖血液中白细胞的吞噬活性、血清中溶菌酶、补体活性等指标，可以反映中华鳖幼鳖机体抗病力的状况。
综上所述，投喂适量的HB-101壮健极品对中华鳖幼鳖的非特异性免疫功能有明显的促进作用，并且对中华鳖幼鳖的生长、机体形态和颜色均没有不良影响。说明在饵料中添加适量的HB-101健壮极品能达到增强中华鳖幼鳖抗病力、预防传染性疾病发生的效果。
参考文献
1 陈昌福，姚 鹃，吴 凡等. 免疫多糖(酵母细胞壁)对中华鳖非特异性免疫功能的影响. 水生生物学报，2004，28(6)：
2 陈昌福，陈 萱，陈超然等. ?-葡聚糖的特性及其对动物免疫功能的调节. 华中农业大学学报，2003，22(1)：95~100
3 陈昌福，陈 萱，陈超然等. 水产甲壳动物的免疫防御机能及其免疫预防研究进展. 华中农业大学学报，2003，22(2)：197~203
4 Robertsen B, Rorstad G, Raa R. Enhancement of non-specific disease resistance in Atlantic salmon, Salmon salar L., by a glucan from Saccharomyces carevisiae cell wall. J Fish Dis, 1990, 13(5)：391~400
5 Anderson D P, Siwicki A K. Duration of protection against Aeromonas salmonicida in brook trout immunostimulated with glucan or chitosan by injection or immersion. The Prog Fish Cult, 1996, 56(3)：258~261
6 Brattgjerd S, Evensen O, Lauve A. Effect of injected yeast glucan on the activity of macrophages in Atlantic salmon, Salmo salar L., as evaluated by in vitro hydrogen peroxide production and phagocytic capacity. Immunology, 1994, 83(4)：288~294
7 Jeney G, Anderson D P. Glucan injection or bath exposure given alone or in combination with bacterin enhance the nonspecific defence mechanism in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, 1993, (116)：315~329
8 Samuel M, Lam T J, Sin Y M. Effect of laminaran [β(1,3)-D-glucan] on the protective immunity of blue gourami, Trichogaster trichopterus against Aeromonas salmonicida. Fish & Shellfish Immunol, 1996, 6(4)：443~454
9 Engstad R E, Robertsen B. Specificity of a beta-glucan receptor on macrophages from Atlantic salmon (Salmo salar L.). Dev Comp Immunol, 1994, 18(4)：397~408
10 陈昌福，赵建培. 中华鳖白点病病原菌的分离与鉴定. 华中农业大学学报，1997，总第25期：101~107
11 杨先乐，周剑光，艾晓辉等. 中华鳖对T3菌苗抗原的免疫应答. 动物学报，2001，47(2)：163~169
12 Sakai M. Current research status of fish immunostimulants. Aquaculture，1999，(172)： 63~92
13 Samuel M, Lam T J, Sin Y M. Effect of laminaran [β(1,3)-D-glucan] on the protective immunity of blue gourami, Trichogaster trichopterus against Aeromonas salmonicida. Fish & Shellfish Immunol, 1996, 6(4)：443~454
14 大野尚仁. βグルカンの生体防御系修饰作用. 日本细菌学杂志，2000，55(3)：527~537
15 Engstad R E, Robertsen B. Specificity of a beta-glucan receptor on macrophages from Atlantic salmon (Salmo salar L.). Dev Comp Immunol, 1994, 18(4)：397~408
16 陈昌福，罗宇良，蔡 冰等. 饲养水温对草鱼溶菌酶活性的影响. 中国水产科学，1996，3(3)：24~30]
Effect of HB-101 on Non-specific Immune Function and Disease Resistance in Juvenile Soft-shelled Turtles (Pelodiscus sinensis) by Oral Administration
Qin Chuanjie1) Xu Zhen1) Xiao Zhimeng1) Chen Changfu1,3)
(1) Fishery College of Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070；
2)State Key Laboratory of Agricultural Microbiology of of Huazhong Agricultural University, 430070)
Abstract The effect of the dietary HB-101 non-specific immune function and disease resistance in juvenile soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis) was studied. The turtles were divided into 6 groups and were fed with feed supplemented with different ratio of HB-101, that was 0 mg/kg(control group)、10.0 mg/kg.B.W.(group I)、20.0 mg/kg.B.W.(group Ⅱ)、30.0 mg/kg.B.W.(group Ⅲ)、40.0 mg/kg.B.W.(group Ⅳ)and 50.0 mg/kg.B.W.(group Ⅴ), respectively. 30 days later, the turtles were blooded, and the phagocytic activity of the leucocytes, serum lysozyme activity, complement activity and disease resistance were monitored. The results showed that the phagocytic activity of the leucocytes were significantly higher than the control group (t-test, p<0.05).The lysozyme activity of the serum in group Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ were significantly higher than the control group (t-test, p<0.05). However, there were no significant differences among group Ⅰ, Ⅱ and the control group (t-test, p>0.05). The highest complement activity of the serum in group Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ were significantly higher than the control group (t-test, p<0.05), which were no significant differences between group Ⅰ and control group (t-test, p>0.05). The results demonstrate that the best supplementation ratio of the activite yeast cell in the soft-shelled turtle is about 20.0 mg/kg. B.W.
Keywods juvenile soft-shelled turtle, HB-101, lysozyme, complement, disease resistence, Aeromonas hydrophila |
